Insulina modula migração celular e a secreção de citocinas na vigência da infecção pulmonar por Paracoccidioides brasiliensis em camundongos diabéticos e não-diabéticos / Insulin modulates cell migration and cytokines secretion during pulmonary infection caused by Paracoccidioides brasiliensis in diabetic and non-diabetic mice

Diabetes mellitus (DM) compreende um conjunto de doenças metabólicas de grande importância e incidência mundial. Nele, o DM do tipo 1 é caracterizado pela destruição de células pancreáticas produtoras de insulina, e dentre seus sintomas, a disfunção imunológica relacionada à falta de insulina foi observada por diversos estudos, descrevendo pacientes diabéticos como mais susceptíveis a infecções e complicações decorrentes destas. Paracoccidioidomicose (PCM) é uma enfermidade sistêmica causada por fungos da espécie Paracoccidioides sp., bastante importante no Brasil e endêmica em toda a América Latina. Este trabalho utiliza um modelo de carência relativa de insulina (DM experimental) para estudar a intervenção da insulina em um modelo de micose pulmonar causada por P. brasiliensis, analisando o processo de migração celular (expressão de moléculas de adesão por imunohistoquímica e fenótipo dos leucócitos do pulmão por citometria de fluxo), os mecanismos moleculares (produção/liberação de citocinas por cytometric bead array), intracelulares (vias de sinalização por Western blot), e a atividade fagocítica e microbicida dos macrófagos alveolares. Em resultados observamos que, comparados aos não-diabéticos, camundongos tornados diabéticos apresentam maior susceptibilidade evidenciada por menor atividade fagocítica e reduzidas secreções de interferon-γ e de interleucina-12 na fase inicial da inflamação, que leva a uma resposta menos efetiva com menor expressão de molécula de adesão de células vasculares, reduzidas populações de linfócitos TCD4+, TCD8+, células natural killer, culminando em inflamação crônica resultante da proliferação aumentada do fungo nos pulmões (aumento de interferon-γ e fator necrótico tumoral-ß). Vemos ainda que o tratamento de insulina em animais diabéticos restaurou as secreções de citocinas pró-inflamatórias e a atividade fagocítica de macrófagos em 24 horas de infecção, e aumentou a celularidade, a expressão de moléculas de adesão de células vasculares-1 e restaurou as populações de linfócitos B, de células natural killer e de células coestimuladas por CD80, além de reduzir a inflamação crônica no pulmão. Estes dados em conjunto nos permitem inferir que a insulina modulou o ambiente inflamatório de animais tornados diabéticos de formas diferentes em estágios iniciais e tardios da infecção pelo isolado Pb18 do Paracoccidioides brasiliensis

Diabetes mellitus comprehends a group of metabolic diseases of great importance and incidence worldwide. Type 1 diabetes mellitus is characterized by destruction of insulin producing-pancreatic cells and, among its symptoms, an impaired immunological function has been observed in many studies having diabetic patients described as more susceptible to infections and complications resulted of them. Paracoccidioidomycosis is a systemic disease caused by fungi of Paracoccidioides spp. , also of great importance in Brazil and endemic in the whole Latin America. This work uses a model of experimental T1DM to investigate the intervention of insulin in a model of murine PCM induced by Paracoccidioides brasiliensis, analyzing the process of cell migration (adhesion molecules expression, leukocyte phenotyping), molecular mechanisms (production and secretion of cytokines), intracellular mechanisms (signaling pathways) and phagocytic and microbicidal activities in alveolar macrophages. In results, compared to controls, we observed higher susceptibility in diabetic mice to PCM, evidenced by reduced phagocytic activity and reduced levels of interferon-γ and interleukin-12 on initial stages of infection, and a less effective inflammation with lesser expression of adhesion molecules, reduced migration of TCD4+, TCD8+, NK cells and B lymphocytes, resulting in chronic inflammation caused by higher fungal proliferation in lungs (higher interferon-γ and tumours necrosis factor-α levels). In addition, we saw treatment with insulin in diabetic animals restored secretion of pro-inflammatory cytokines and phagocytic activity on early stages and allowed higher cellularity, higher expression of vascular cells adhesion molecule-1 and restored populations of B lymphocytes, NK cells and the expression of costimularoty molecule CD80, also reducing the chronic inflammation in lungs. Taken together, these data lead us to suggest insulin modulated the inflammatory microenvironment in lungs of mice rendered diabetic, in different forms on earlier and later stages of an infection by Pb18 isolate

Isolation, cultivation and immunofluorescence characterization of lamellar keratinocytes from equine hoof by using explants / Isolamento, cultivo e caracterização por imunofluorescência de queratinócitos lamelares de casco equino utilizando explantes

The importance of the hoof to the horse health is clear, and the current knowledge regarding the cellular aspects of hoof keratinocytes is poor. Studies on equine keratinocyte culture are scarce. Developing keratinocyte cultures in vitro is a condition for studies on molecular biology, cell growth and differentiation. Some methods have already been established, such as those for skin keratinocyte culture. However, few methodologies are found for lamellar keratinocytes. The objective of this study was to standardize the equine hoof keratinocyte isolation and cultivation, and then characterize the cell immunophenotype. For this, the primary culture method used was through explants obtained from three regions of the equine hoof (medial dorsal, dorsal, and lateral dorsal). After the cell isolation and cultivation, the cell culture and its explants were stained with anti-pan cytokeratin (pan-CK) (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4), and Ki-67 (MIB-1) antibodies. Cells were grown to third passage, were positive for pan-CK, p63 and Ki-67, and few cells had vimentin positive expression. As for the explants, the epidermal laminae were not stained for vimentin or Ki-67. However, some cells presented positive pan-CK and p63 expression. This study demonstrated the viability of lamellar explants of equine hooves as a form of isolating keratinocytes in primary cultures, as well as characterized the proliferation ability of such keratinocytes in monolayers.(AU)

É notória a importância do casco na saúde dos equinos, mas o conhecimento em nível celular é pouco entendido. Estudos envolvendo o cultivo de queratinócitos equinos são escassos. Sabe-se que o desenvolvimento de cultivos de queratinócitos in vitro é uma condição para estudos sobre a biologia molecular, crescimento e diferenciação celular. Alguns métodos já estão estabelecidos, como para cultivo de queratinócitos de pele, mas poucas metodologias são encontradas para queratinócitos lamelares. O objetivo desse estudo foi padronizar o cultivo de queratinócitos provenientes de casco equino visando futuramente associar ao estudo da medicina regenerativa para assim estabelecer um modelo experimental in vitro e indicar o uso criterioso de terapias regenerativas para a laminite equina. Desta forma, o cultivo em monocamada e a caracterização de queratinócitos lamelares foram realizados. Para isso, o método de cultura primária utilizado foi através de explantes obtidos de três regiões do casco (dorso-medial, dorsal e dorso-lateral). As células foram caracterizadas para os marcadores anti pan-cytokeratin (AE1/AE3), vimentin (V9), p63 (4A4) e Ki-67 (MIB-1) nos cultivos e nos explantes. As células foram cultivadas até terceira passagem, tendo marcação positiva para pan-CK, p63 e Ki-67 e fraca marcação para vimentina. Já as lâminas epidermais não tiveram marcação de vimentin e Ki-67, porém marcaram acentuadamente para pan-CK e p63. Este estudo demonstrou a exiquibilidade do uso de explantes lamelares do casco de equinos, como forma de isolamento de queratinócitos em cultivos primários, bem como caracterizou a habilidade de proliferação desses queratinócitos em monocamada.(AU)

Estudo funcional da proteína MRCK-ß em adenocarcinomas colorretais metastáticos ou não / Functional study of the MRCK-ß protein in metastatic or non-metastatic colorectal adenocarcinoma

Introdução: O câncer colorretal (CCR) é uma neoplasia de origem epitelial e abrange tumores de cólon e reto em homens e mulheres. É uma doença tratável e frequentemente curável quando na ausência de extensão para outros órgãos. No entanto, aproximadamente 50% a 60% dos pacientes diagnosticados com CCR irão desenvolver metástases que são mais comumente encontradas em fígado e pulmão. MRCK-ß mediada por Cdc42 tem um papel importante na migração e metástase devido a sua capacidade de promover rearranjos do citoesqueleto. E ROCK2, mediada por RhoA também esta relacionado à capacidade de invasão e migração. Objetivo: Avaliar a importância das proteínas MRCK-ß e Cdc42 no processo de migração celular e formação de metástases em adenocarcinomas colorretais através estudos de expressão gênica, expressão proteína e estudos funcionais em linhagens celulares. Materiais e Métodos: 60 casos com CCR que desenvolveram metástases e 48 casos que não desenvolveram metástase foram selecionados e seu material parafinado foi resgatado para avaliação proteica. Imunoistoquímica foi realizada para os marcadores anti-MRCK-ß, anti-Cdc42 e anti-ROCK2, as reações foram analisadas de forma manual através do sistema Envision FLEX/HRP (DAKO®). A partir de amostras do banco de tumores, presentes no Biobanco da Patologia Investigativa do AC Camargo Cancer Center, foram extraídos RNAs para avaliar a expressão gênica de Cdc42 e MRCK-ß. A superexpressão proteica de MRCK-ß foi avaliada através da linhagem celular SW480 e foram realizados ensaios de migração por transwell e a inibição da expressão foi realizada na linhagem HCT116. Resultados: Cdc42 e ROCK2 mostraram maior expressão nos tumores não metastáticos e MRCK-ß nos tumores metastáticos, todos com um valor p < 0,001. Entre os tumores primários e suas metástases, ROCK2 mostrou estar mais expresso no tumor primário (p = 0,042). Os marcadores também foram avaliados através do qRT-PCR e não mostram correlação com a expressão imunoistoquímica. Os ensaios de migração mostraram que quando ocorre a superexpressão de MRCK-ß as células apresentam maior capacidade de migração (p = 0,017). Conclusões: MRCK-ß mostrou expressão apenas entre os tumores metastáticos e maior expressão na linhagem HCT116, que possui um maior potencial metastático. Quando a superexpressão de MRCK-ß foi ampliada na linhagem SW480, foi avaliado que a capacidade de migração celular é aumentada indicando ser um potencial marcador de metástase em câncer colorretal (AU)

Introduction: Colorectal cancer (CRC) is a neoplasia of epithelial origin and covers tumors of the colon and rectum tumors in men and women. It is a treatable and often curable disease when in the absence of extension to other organs. However, approximately 50% to 60% of patients diagnosed with CRC will develop metastases that are most commonly found in the liver and lung. MRCK-ß mediated by Cdc42 plays a role in migration and metastasis due to its ability to rearrangements of the cytoskeleton. And ROCK2, mediated by RhoA is also related to the capacity of invasion and migration Aim: To evaluate the importance of MRCK-ß and Cdc42 proteins in the process of cell migration and formation of metastases in colorectal adenocarcinomas through studies of gene expression, protein expression and functional studies in cell lines. Materials and Methods: 60 cases of CRC that developed metastases and 48 cases that did not develop metastasis were selected and their paraffin material was rescued. Immunohistochemistry was performed for the anti-MRCK-ß, anti-Cdc42 and anti-ROCK2 markers, reactions were analyzed manually using the Envision FLEX / HRP (DAKO®) protocol. RNAs samples from the tumor bank, presents on Biobank of Investigative Pathology of AC Camargo Cancer Center, were extracted to evaluate the gene expression of Cdc42 and MRCK-ß. The overexpression of the protein of MRCK-ß was evaluated through the SW480 cell line and transwell migration assays were performed and the inhibition of expression was performed in the HCT116 Results: Cdc42 and ROCK2 showed higher expression in non-metastatic tumors and MRCK-ß in metastatic tumors, all with a p-value of <0.001. Among primary tumors and their metastases, ROCK2 showed to be more expressed in the primary tumor (p = 0.042). The markers were also evaluated through qRT-PCR and did not show correlation with immunohistochemical expression. The migration assays showed that when MRCK-ß overexpression occurs the cells have a higher migration capacity (p = 0.017). Conclusions: MRCK-ß showed expression only among metastatic tumors and greater expression in the HCT116 cell line, which has a higher metastatic potential. When overexpression of MRCK-ß was amplified in the SW480 cell line, it was evaluated that the cell migration capacity was increased indicating to be a potential marker of metastasis in colorectal cancer (AU)

Preliminary study on the anti-inflammatory and antioxidant activities of the leave extract of Hyptis fruticosa Salzm. ex Benth., Lamiaceae / Avaliação das atividades anti-inflamatória e antioxidante do extrato etanólico das folhas da Hyptis fruticosa Salzm. ex Benth., Lamiaceae

Various species of Hyptis are used in folk medicine as anti-inflammatory. In order to evaluate the actions of Hyptis fruticosa Salzm. ex Benth., Lamiaceae, studies were performed on anti-inflammatory and antioxidant activities. The ethanol extract (EE) of H. fruticosa leaves and its n-CH, CHCl, EtOAc, and MeOH/HO partitions were used in the following experiments. Oral treatment with the EE of H. fruticosa leaves (100, 200, and 400 mg/kg) or its n-C6H14, EtOAc, and MeOH/H2O partitions (50, 100, and 200 mg/kg) elicited inhibitory activity (p<0.05) on carrageenan-induced oedema formation and leukocyte migration into the peritoneal cavity in rats. However, the CHCl3 partition did not show any inhibitory effect on paw oedema and peritonitis experimental models. The EE and EtOAc partition present highest antioxidant potential (IC50 = 35.00±1.01 and 36.67±2.65 µg/mL DPPH, respectively), similar to the reference compound (IC50 = 16.67±1.21 µg/mL). In conclusion, H. fruticosa shows anti-inflammatory and antioxidant activities.

Várias espécies do gênero Hyptis são utilizadas na medicina popular para tratar processos inflamatórios. Para avaliar as ações anti-inflamatória e antioxidante da Hyptis fruticosa Salzm. ex Benth., Lamiaceae, utilizou-se extrato etanólico (EE) das folhas desta planta e suas partições n-C6H14, CHCl3, AcOEt e MeOH/H2O. O tratamento oral com o EE das folhas da H. fruticosa (100, 200 e 400 mg/kg) ou suas partições n-C6H14, AcOEt e MeOH/H2O (50, 100 e 200 mg/kg) apresentou atividade inibitória sobre a formação de edema e migração leucocitária para a cavidade peritoneal induzidas pela carragenina em ratos (p<0,05). Entretanto, a partição CHCl3 não causou nenhum efeito sobre a formação de edema e migração de células peritoneais. O EE bruto e a partição AcOEt apresentaram alto potencial antioxidante (IC50 = 35,00±1,01 e 36,67±2,65 µg/mL DPPH, respectivamente), similar ao composto referência (IC50 = 16,67±1,21 µg/mL). Em conclusão, demonstrou-se que a H. fruticosa apresenta atividades anti-inflamatória e antioxidante.

Diazepam, em dose única, inibe a migração celular, a estimulação macrofágica e a atividade de TNF-α na reação inflamatória aguda induzida por LPS em camundongos / Diazepam, in a single dose, inhibits cellular chemotaxis, macrophage stimulation, and TNF-α activity in LPS-induced acute inflammatory responses in mice

Os benzodiazepínicos estão entre as drogas mais freqüentemente prescritas em razão de suas propriedades ansiolíticas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do diazepam sobre a resposta inflamatória peritoneal aguda induzida por lipopolissacarídeo. Para tanto, camundongos Swiss foram tratados com diazepam (1 ou 10 mg/kg de peso), em dose única, por via subcutânea, uma hora antes do desafio intraperitoneal com lipopolissacarídeo bacteriano. Após 16 horas do desafio, os animais foram sacrificados, coletando-se os lavados peritoneais para determinação do número total de células e das subpopulações de mononucleares e polimorfonucleares, além da atividade de TNF-α e da porcentagem de macrófagos espraiados. Observou-se que o tratamento com diazepam, nas doses de 1 ou 10 mg/kg, reduziu significativamente a porcentagem de macrófagos estimulados por LPS e a liberação de TNF-α independente de estímulo. Houve também significativa redução da migração de leucócitos nos animais estimulados com LPS e tratados com 10 mg/kg de diazepam em relação aqueles não tratados. Concluímos que a administração do diazepam, em dose única, pode influenciar significativamente o influxo celular, a estimulação de macrófagos e a atividade de TNF-α na resposta inflamatória aguda induzida por LPS em camundongos, com possíveis implicações na eficiência da resposta anti-infecciosa.

Benzodiazepines are one of the most frequently prescribed drugs due to their anxiolytic properties. The aim of this study was to evaluate the effects of diazepam on lipopolysaccharide-induced peritoneal acute inflammatory responses. Swiss mice were treated with diazepam in a single dose of 1 or 10 mg/kg- subcutaneously 1 h before an intraperitoneal injection of lipopolysaccharide or sterile saline solution. The mice were killed 16 h after and the cells were washed from the peritoneal cavity to determine the total number of cells and the mononuclear and polimorfonuclear subpopulations, as well as the TNF-alpha activity and percentage of spread macrophages. Our results showed that the diazepam treatment (1 and 10 mg/kg) induced a significant reduction in the LPS-induced macrophage stimulation and TNF-α activity. Diazepam (10 mg/kg) also reduced the inflammatory cellular migration when compared to the control. It can be concluded that the diazepam treatment in a single dose is able to influence the inflammatory cellular influx, macrophage stimulation and TNF-α activity in the acute inflammatory response in mice, having possible implications on the anti-infectious response efficiency.